当病毒侵略哺乳动物细胞时,开始辨认病原DNA收到这一“情报”的蛋白宣布信号,向下一个蛋白传递,环环相扣,激活天然免疫反响。哺乳动物细胞正是使用这样的多条天然免疫通路,介导免疫应对。
北京时间2020年6月1日晚23点,《天然-微生物学》(Nature Microbiology)在线宣布了我国科学院生物物理所高璞、章新政团队的最新研讨效果。这项研讨着眼一种细菌辨认外源侵略DNA的免疫防护体系,即I型限制润饰(Type I R-M)体系。
研讨人员使用冷冻电镜技能体系性解析了Type I R-M体系与靶标DNA及两种噬菌体按捺蛋白(Ocr和ArdA)的多种生理构象的三维结构,并协作骤变及生化剖析,提醒了该体系的拼装、催化和调控机制。
Type I R-M体系广泛存在于原核生物中,可以对宿主本身DNA进行甲基化润饰,并对未经润饰的噬菌体DNA进行辨认和切开,从而为宿主细胞供给强壮的天然免疫维护。
高璞向《我国科学报》介绍,自1968年,这一体系被判定以来,许多研讨人员使用微生物学、生物化学及分子生物学等手法对其展开了广泛研讨。
“例如,咱们已知道:该体系包含的亚基(蛋白)品种、不同Type I R-M体系特异辨认的靶标DNA序列、Type I R-M体系存在的拼装办法、以及噬菌体编码蛋白可按捺该体系的活性等等。”
可是,在分子乃至原子水平上,依然有许多问题未得到答复,包含:不同亚基之间怎么彼此效果并拼装成有特定功用的复合物?Type I R-M体系是否以及怎么经过构象改变来准确调控不同的酶活性?Type I R-M动态构象改变的结构根底是什么?噬菌体蛋白按捺Type I R-M体系酶活性的分子机制是什么?
为了答复这样一些问题,则一定要了解Type I R-M体系在不同构象状况及拼装办法下的结构信息。
多年来,高璞一向致力于提醒Type I R-M体系的拼装、催化和调控机制。2011年,他在攻读博士期间,就解析了该体系DNA辨认亚基的晶体结构。2017年,他与中科院生物物理所梁栋材院士课题组协作,解析了该体系甲基化酶复合物在不结合靶标DNA状况下的晶体结构。而此次的最新效果,则是他们团队与章新政课题组协作,解析了该体系多个生理状况下的冷冻电镜结构。
根据本项最新研讨,研讨人员将Type I R-M全酶的作业模型表述为以下6个进程:
1、未结合靶DNA时,全酶复合物处于一种动态敞开的Resting State;
5、经过两个R亚基的协同效果,全酶复合物进入Restriction State,两个R亚基的Nuclease结构域和两个M亚基的Catalytic结构域均接近DNA,发挥DNA切开和甲基化润饰功用;
6、切开和润饰完毕后,全酶复合物与DNA彼此别离并返回到初始的Resting State。
为了更清楚的了解上述状况改变进程,研讨人员在冷冻电镜的协助下“凝结”了其间的多个瞬间。
“首要试验的第一步是要取得高质量的复合物样品,咱们采纳细胞内共表达以及体外重组相结合的办法,以经典的Type I R-M体系EcoR124I为研讨目标,制备了中心复合物M2S1以及全酶复合物R2M2S1。然后,进一步取得了它们与靶标DNA及两种噬菌体按捺蛋白(Ocr和ArdA)的复合物样品。”高璞表明。
接下来,研讨人员使用冷冻电镜单颗粒重构办法,探索了上述多种复合物样品的制样及数据搜集条件,并解析了不同分辨率的共10种状况的三维结构。
事实上,环绕Type I R-M体系为什么可以转位、切开、以及润饰DNA,前人的研讨现已了解其在不同阶段会显示出不同的酶活性,可是却不了解这一个大的分子机器产生状况改变的根本原因。
冷冻电镜技能为了解这一进程的空间构象改变供给了“利器”。例如,在第一个阶段,Type I R-M体系只要转位酶的活性、不具有切开和甲基化活性,原因是其酶切活性中心在结构上被“挤”在中心,构成“自我按捺”的状况;而甲基化酶催化域也一起间隔DNA较远,导致其不具备甲基化活性。
中科院生物物理所成像中心渠道为本研讨冷冻电镜数据搜集和样品剖析等作业供给了支撑。
有关这项研讨的含义,除了有助于了解根底生物学问题,Type I R-M体系作为生物学东西开发的含义也应得到满足注重。在原核细胞中,“R-M体系”及“CRISPR-Cas体系”是细菌去除侵略的噬菌体DNA的两种防护体系,而这两种体系都现已被开发成强壮的生物学东西,被大范围的应用于当时的生物医学研讨中。
高璞着重,因为R-M体系中的酶能辨认特异的DNA序列并进行润饰和切开,因而,当下的分子克隆等试验中,都要广泛用到R-M体系。不过,Type I R-M体系尽管最早被发现,但其东西开发却一向相对滞后,正是因为我们对它的作业机制了解的不行透彻。
因而,对Type I R-M体系作业细节的了解,有助于将来对其进行生物学东西开发。
一起,在细菌对外源DNA的免疫辨认方面,此项研讨提醒了Type I R-M体系的拼装、催化和调控的分子机制,并且大部分都是之前未报导的机制,这有助于深化了解该防护体系与噬菌体之间的彼此博弈。
在结构生物学技能方面,Type I R-M体系多种生理构象的三维结构解析,是困扰本范畴数十年的难题,本作业是初次体系性提醒了多种构象的结构根底。